它是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。在該技術(shù)中，有一個很重要的概念是Ct值。C代表Cycle, t代表threshold, Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

　　熒光定量pcr常用的兩種方法分別為：熒光染料摻入法和探針法

　　1、熒光染料摻入法

　　熒光染料摻入法原理是：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。

　　2、探針法

　　探針法熒光定量pcr原理是：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報(bào)告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成同步。